吐峪沟石窟位于新疆维吾尔自治区吐鲁番地区鄯善县吐峪沟乡，是吐鲁番地区目前已知开凿年代最早的石窟，是高昌时代最早、规模最大的一座石窟。

石窟始建于4世纪。5～6世纪，北凉至麹氏高昌时期建寺凿窟达到热潮，并成为皇家寺院所在。7～12世纪，回鹘高昌时期也有开凿或改凿洞窟。13世纪，随着伊斯兰教的传播逐渐废弃。20世纪初，外国探险队至此盗割盗掘，大量珍贵文物流失海外。

洞窟沿吐峪沟两侧南北长约500米的范围内分布。分东西二区，现存洞窟总计为94个，编号洞窟46个，其中仅有9个窟留有壁画。其窟形可分为方型窟、中心柱窟和纵券顶窟。方形窟以其窟顶形式，又可分为平顶式、覆斗式、穹庐式。石窟类型有支提窟、毗诃罗窟和讲经窟3种。以禅窟和讲经窟数量最多，计37个窟，且分居于礼拜窟左右，与克孜尔石窟布局相似，反映了中国早期石窟特征。

吐峪沟石窟的壁画大部剥落严重，较能辨其内容的第44窟中，正壁和两侧壁上均绘一佛二菩萨。本生故事画较为清晰，计每壁各有1组7幅画，每幅画旁有汉文题记。尚可辨认的壁画内容有：“羼提婆利忍辱截割手足”、“摩钳太子求法赴火”、“慈力王施血饮五夜叉”、“萨那太子舍身饲虎”和“毗楞竭梨王身钉千钉”、“尸毗王割肉贸鸽”等。

吐峪沟石窟是高昌地区已知开凿年代最早的石窟，是中原佛教文化与西域佛教文化最早交汇的地区。洞窟形制和壁画遗存反映出多种文化对高昌石窟艺术的影响，是我国佛教艺术的艺术宝库。吐峪沟石窟附近古老的传统建筑形制的民居使用至今，在中国土质建筑史上也是罕见的。吐峪沟石窟周围的祆教墓葬、佛教寺院、伊斯兰教麻扎，反映了当地多种宗教、多种文化的深厚历史底蕴。

2006年5月，吐峪沟石窟作为南北朝至唐时期的石窟，被国务院批准列入第六批全国重点文物保护单位名单。